Меню
Яндекс.Метрика

Ретровирусы человека

Вирусы лейкоза Т-клеток человека (HTLV) являются ретровирусами, реплицирующимися преимущественно в лимфоцитах человека. Инфицирование HTLV типа I ассоциировано с развитием специфического типа лейкемии Т-клеток у взрослых, которая с нарастающей частотой встречается в южной Японии и странах Карибского бассейна. Инфицирование in vitro штаммом HTLV-I культуры Т-клеток человека подтверждает способность вызывать рост независимо от экзогенных факторов роста Т-клеток (иммортализация). Инфицирование другим вирусом, называемым HTLV-III, ассоциируется с синдромом приобретенного иммунодефицита. То же самое справедливо для вируса LAV, ранее ассоциированного с лимфаденопатией. По-видимому, HTLV не содержат клеточно-зависимых онкогенов. Вместо этого они меняют поведение клетки-хозяина уникально взаимодействующими вирусными регуляторными белками.

Нормальная человеческая ДНК содержит структуры, которые могут оказаться провирусами и генетически передаются половыми клетками. Значимость таких структур неизвестна.

Активированные клеточные онкогены, детектируемые трансфекцией. Трансфекционный тест на онкогены. Некоторые из известных клеточных линий обладают способностью инкорпорировать экзогенную ДНК в свой хромосомный аппарат с такой эффективностью, что появляется возможность экспериментального введения гена (трансфекции) непосредственно в культуру тканей. Технология трансфекции обычно заключается в осаждении ДНК на поверхность клеток-мишеней фосфатом кальция с последующим поглощением ДНК внутрь клетки посредством пиноцитоза. Некоторые из поглощенных молекул ДНК транспортируются в клеточное ядро и интегрируются в хромосомную ДНК. Если трансфектированная ДНК содержит ген, который может экспрессироваться в клетке-реципиенте как доминантный селектируемый маркер, то клетки, экснрессирующие этот признак, могут быть обнаружены в культуре с эффективностью до одной клетки на каждые 105 событий трансфекции. Многие из вирусных онкогенов. (с м. табл. 59-1) могут вызвать трансформации в тестах описанного типа. Трансформация такого рода имеет место как при использовании чистой онкогенной ДНК, так и при использовании хромосомной ДНК клеток, трансформированных ретровирусами.

Таблица 59-3. Онкогены, обнаруженные в опухолях человека трансфекцией клеток NiH/3ТЗ

Онкоген

Опухоли или опухолевые линии клеток

с-гас"

Линии клеток из, карциномы мочевого пузыря EJ/T24, карциномы легкого и карциносаркомы молочной железы

c-rac к

Карциномы легкого, толстой кишки, мочевого пузыря, поджелу-

г acN

Нейробластома, фибросаркома, промиелоцитарный и острый мие-лоцитарный лейкоз, лимфома Беркитта и карцинома толстой кишки

HuBlym-1

Несколько линий клеток из лимфомы Беркитта

Tlym-1

Линии клеток из Т-клеточной лимфомы

Клонированный ген Tlym-1 мышиного происхождения. Судя по паттернам инактивации рестриктазами, аналогичный трансформирующий ген активирован в линиях из Т-клеточных лимфом человека.

С помощью данной технологии можно обнаружить также активированные клеточные онкогены в ДНК опухолей, вирусная природа которых не доказана. Например, трансформирующие гены содержатся в ДНК химически трансформированных клеток животных и в ДНК клеток разнообразных опухолей человека и животных нативного происхождения. Нормальная высокомолекулярная ДНК человека не трансформирует клеток, однако трансформирующие гены можно активировать фрагментацией нормальной клеточной ДНК. Эти результаты подтверждают концепцию об активации протоонкогенов нормального генома при формировании опухоли, но они ничего не говорят о том, является ли активация трансформирующих генов причиной или следствием неопластического фенотипа. Хотя лишь небольшая часть ДНК опухолей человека проявляет трансформирующие свойства при трансфекции, эти наблюдения открывают новые пути исследования молекулярной генетики новообразований человека.

Семейство клеточных онкогенов ras. Некоторые из трансформирующих генов, обнаруженные путем трансфекции клеток с помощью ДНК, взятой из клеток опухолей человека, в настоящее время идентифицированы (табл. 59-3). В основном эти онкогены принадлежат к семейству генов, называемому гас. Первым был идентифицирован человеческий гомолог онкогена вируса мышиной саркомы Гарвея (см. табл. 59-1), названный с-гасВ, кодирующий белок с мол. м ассой 21 000, названный р21. Этот онкоген был активирован в линии клеток, выделенных из карциномы мочевого пузыря человека. Уровень экспрессии белка р21 в клетках, Трансформированных вирусом сарком.ы Гарвея, достаточно высок, и высокоуровневая экспрессия с-гасВ, вызываемая в эксперименте сцеплением этого клеточного гена с вирусными регуляторными элементами, достаточна для индуцирования трансформации клеток. Однако в тех линиях клеток опухолей человека, в которых с-r асВ обнаруживается, он не проявляет высокого уровня экспрессии. Вместо этого способность к трансформации клеток определяется, по-видимому, точечными мутациями, которые приводят к подмене аминокислот в 12-й или 61-й аминокислотной позиции белка р21. Таким образом, этот протоонкоген активируется либо изменением регуляции, либо мутациями в структуре белка.

Чаще активирован в человеческих опухолях второй ген семейства гас— человеческий гомолог трансформирующего гена вируса мышиной саркомы Кир-стена, названный с-гас О коло 10—20% ДНК из различных новообразований человека содержит ген с-rасВ, трансформирующий клетки при трансфекции (см. табл. 59-3). Белок, кодируемый геном с-rасВ,—э то та же самая молекула р21, и его трансформирующая активность связывается со структурной мутацией белка, подобной той, что наблюдается для гена с-rасВ. Эта мутация отсутствует в ДНК, извлеченной из нормальных тканей больных, пораженных карциномами, которые содержат активированный ген с-r асВ; это обстоятельство свидетельствует, что активация является соматическим событием, происходящим в процессе формирования опухоли. И наконец, в других экспериментах с трансфекцией ДНК, извлеченной из некоторых опухолей, трансформация индуцируется третьим членом этого семейства, называемом rasN Активация rasN имеет место в 10—20% случаев острых миелоидных лейкемий человека.

Активация генов ras обычна для некоторых химически индуцированных эпителиальных карцином у грызунов, что предполагает активацию этих генов химическими карциногенами. Однако у человека активированные ras-гены найдены лишь в небольшой части опухолей. Это означает, что в человеческих опухолях имеют место еще не идентифицированные изменения генов ras, либо то, что в процессе развития опухолей вместо изменения генов ras происходит изменение других генов. Ни одна из этих вероятностей не может быть определена посредством стандартных опытов по трансфекции. Возможна и другая альтернатива — активация всех онкогенов может оказаться результатом неопластического состояния, а не его первопричиной. Формального доказательства причинной роли активированных ras-генов в тех опухолях человека, в которых они обнаруживаются, не имеется.

Возможные клеточноспецифические онкогены. В отличие от генов семейства ras, проявляющих активность при новообразованиях многих типов, активация других онкогенов может оказаться специфичной для неопластических состояний клеток определенного типа. Первым из этой группы был идентифицирован ген, названный ChBlym-1. ДНК из лимфом цыплят, индуцированных вирусом птичьего лейкоза, трансформирует клетки при трансфекции, в то время как ДНК из нормальных тканей тех же самых птиц этим свойством не обладает. Ген Ch Blym-1, который, как полагают, отвечает за эту активность, был получен из клеток, трансформированных ДНК, выделенной из клеточных линий лимфомы фабрициевой сумки. Этот ген, по-видимому, не имеет отношения к ras или другим вирусным онкогенам, описанным в табл. 59-1. Как и для других онкогенов, нуклеотидные последовательности ChBlym-1 законсервировались в процессе эволюции и постоянно присутствуют в ДНК человека.

Как. и вирусиндуцированные лимфомы цыплят, человеческая лимфома Беркитта состоит из тех же самых В-клеток, находящихся примерно на той же стадии дифференциации. ДНК, извлеченная из клеток большинства линий лимфомы Беркитта, может трансформировать клетки при трансфекции. Это свойство объясняется, по-видимому, активностью гена, называемого HuBlym-1, который на уровне последовательностей ДНК на 50% гомологичен гену ChBlym-1. Таким образом, онкогены Blym активированы в В-клеточных лимфомах как цыплят, так и людей, но в опухолях других типов их не обнаруживают. Поскольку характеристики нормальных гомологов этих трансформирующих генов неизвестны, то неизвестны и молекулярные причины их активации.

Другие В- и Т-клеточные новообразования и аденокарциномы молочной железы содержат трансформирующие гены, которые, похоже, различны для каждого типа опухоли. Например, трансформирующий ген новообразований с промежуточной стадией дифференциации Т-клеток, называемый Tlym-t, отличен от других известных онкогенов.

Онкогены, участвующие в образовании опухолей, вызываемых хромосомными транслокациями и другими перестройками. Третья волна свидетельств об активации, онкогенов в процессе формирования опухоли возникла из анализа цитогенетических изменений в новообразованиях человека. Большинство опухолей человека являются клональными, или олигоклональными, т. е. в популяции составляющих их клеток доминирует потомство одной или нескольких клеток. В определенных новообразованиях доминантные клеточные клоны маркированы существенными хромосомными аномалиями, такими, например, как реципрокные гранслокации между хромосомами 9 и 22 при хроническом миелогенном лейкозе (с образованием филадельфийской хромосомы, Р h ) или между хромосомами 8 и 14 в случае лимфомы Беркитта. В настоящее время характеристические неслучайные хромосомные изменения идентифицированы для многих новообразований. Гены, находящиеся в сайте перестроенной ДНК или рядом с ним и являющиеся первопричиной этих цитогенетических изменений, могут играть определенную роль в развитии опухолей. Успехи гибридизации in situ и других методов генетики соматических клеток дали возможность определить приблизительные положения ряда протоонкогенов в хромосомах человека (табл. 59-4). Некоторые из этих генов расположены вблизи точек разрыва хромосом, трансформируемых при определенных опухолях.

Таблица 59-4. Локализация некоторых протоонкогенов в хромосомах человека

Ген

Хромосома

Суб-локализация в хромосоме или зона

с-тус

8

q24

с-аЫ

9

434

c-mos

8

q22

c-fes

15

q24—q25

c-myb

6

q22—q24

c-mil (raf)

3

р 25

N-ras

1

cen-^p21

c-ras"

11

р 14.1

c-ras"

12

р 12.05-^ter

c-etc

11

q23—q24

c-erbB

7

pter-^q22

c-erbA

17

q21—q22

HuBlum-1

1

p32

c-fms

5

q34

c-fos

14

q21-^q31

c-ski

1

NA

c-sis

22

qll-^ter

c-src-1

20

p34—p36

c-src-2

1

ql2^ter

q — длинное плечо хромосомы, р — короткое плечо хромосомы, сеn — центромер, ter терминал, NA — неизвестно.

Перестройка локуса с-m ус в клетках лимфомы Беркитта. Как показано в табл. 59-4, c-myc ген человека расположен на хромосоме 8. Эта хромосома неизменно участвует в транслокации клеток лимфомы Беркитта. На уровне ДНК транслокация состоит в рекомбинации между c-myc локусом хромосомы 8 и локусом гена иммуноглобулина, расположенного обычно вблизи гена тяжелой цепи в хромосоме 14 или, реже, вблизи гена легкой цепи в хромосомах 2 или 22. По-видимому, эта транслокация не влияет на ту часть c-myc локуса, которая кодирует белок, но воздействует на регуляцию его экспрессии. Аналогичные транслокации, приводящие к рекомбинации между c-myc и генами иммуноглобулина имеют место и в плазмацитомах мышей.

Альтерации экспрессии гена с -abl в результате хромосомной транслокации при хроническом миелолейкозе. У большинства больных с хроническим миелолейкозом (ХМЛ) хромосома Р h присутствует как в пораженных клетках, так и в поколениях нормальных клеток костного мозга. Считается, что при этом заболевании костный мозг и периферическая кровь заселены потомками кроветворной стволовой клетки, которые сохраняют способность дифференцироваться в красные кровяные клетки, мегакариоциты и гранулоциты. Однако пролиферация гранулоцитов аномальна и чрезмерна, что и вызывает клинические проявления ХМЛ. Гены, экспрессия которых альтерируется вследствие формирования филадельфийской хромосомы, должны рассматриваться как возможные виновники развития ХМЛ. Человеческий гомолог протоонкогена с -abl (см. табл. 59-1) расположен вблизи точки разрыва хромосомы 9 при транслокации 9—22 и при обмене переходит в хромосому 22. Оказалось, что в Р h -хромосоме экспрессия с-аЫ претерпевает количественные и качественные изменения. Уровни c-abl РНК возрастают, а оба предоминантных РНК-транскрнпта гена и с-аЫ белка становятся больше, чем c-abl РНК и белковые молекулы нормальных клеток. Полагают, что РНК и белковые продукты c-abi локуса клеток ХМЛ включают в себя совокупный продукт c-abi и гена, называемого bcr (breakpoint claster region — область разрывного кластера), расположенного в точке разрыва на рекомбинантной Рh-хромосоме Е сли эта альтерация c-abi и играет роль в развитии ХМЛ, то это должно проявляться на ранней стадии заболевания.

Амплифицированные протоонкогены в опухолях человека. Увеличение числа копий гена на клетку (амплификация гена) иногда проявляется на цитогенетическом уровне формированием небольших хромосомоподобных структур, называемых двойными малыми хромосомами, или появлением гомогенно окрашенных участков (ГОУ) в регуляторных хромосомах. ГОУ появляется в результате амплификации сегментов ДНК до такой степени, что это обнаруживается цитогенетически. Как следствие такая структура содержит множественные копии гена (генов), закодированных в данном сегменте ДНК. В нетрансформированных клетках амплификацию гена можно иногда индуцировать выращиванием клеток в специальных условиях. Например, клетки с амплифицированным геном дигидрофолатредуктазы, которая необходима для репликации ДНК, можно получить, если выращивать их (с последующим отбором) в присутствии небольшого количества метотрексата— ин гибитора дигидрофолатредуктазы. При увеличении числа копий гена возрастает производство фермента в клетке и тем самым компенсируется действие ингибитора. Двойные малые хромосомы и ГОУ присутствуют во многих разновидностях опухолевых клеток, так что можно предположить, что гены, критические для роста неопластических клеток, могут амплифицироваться в процессе формирования опухоли.

Первым амплифицированным онкогеном, опознанным в опухолевых клетках человека, был ген c-myc, который экспрессировался на высоком уровне в одном случае промие.л оцитарного лейкоза как в исходных опухолевых клетках, так и в производных линиях клеток. Амплификация c-myc при этом заболевании оказалась редким событием и в других случаях промиелоцитарного лейкоза не наблюдалась. Однако двойные малые хромосомы, амплификация c-myc генов и повышенный уровень c-myc РНК наблюдались в ряде случаев рака желудка и мелкоклеточного рака легкого, а амплификация протоонкогена наблюдалась в двух линиях клеток из карциномы толстой кишки человека. Высокая частота двойных малых хромосом и ГОУ характерны для нейробластом человека. Ген, называемый N-myc и родственный гену c-myc, имеет высокий уровень амплификации и/или экспрессии в большинстве нейробластом, в производных от нейробластом линиях клеток и в других нейроэндокринных опухолях. Степень амплификации и/или экспрессии N-myc может сильно варьировать в пределах популяции опухолевых клеток.

Читать далее: Функция онкогенов