Меню
Яндекс.Метрика

Диагностические методы и объекты исследования

Физиологические жидкости. Большинство сведений о врожденных ошибках метаболизма и методах их выявления было получено в результате химических исследований крови или мочи, позволивших обнаружить специфические биохимические нарушения и во многих случаях открыть пути к изучению ферментов и выяснению конкретного дефекта. Они дали также возможность скрининга крупных популяций, облегчив тем самым выявление больных еще до появления у них явных клинических симптомов. Использование методов скрининга по крови и моче позволило обнаружить гетерозиготных носителей многих заболеваний. Эти методы часто помогают также проследить эффекты некоторых диетических и лекарственных средств или заместительной терапии.

Анализ тканей. Определение ферментов и биохимические исследования тканей человека, полученных путем биопсии, позволили обнаружить специфические ферментные нарушения более чем при 100 метаболических аномалиях. При таких заболеваниях, как наследственный сфероцитоз, цистинурия и синдром нарушения всасывания глюкозы — галактозы, invitroбыли выявлены и нарушения мембранного транспорта. Эти исследования в дополнение к доказательствам аномальности продуктов отдельных генов часто позволяют идентифицировать биохимическую и генетическую гетерогенность, свойственную врожденным ошибкам метаболизма.

Исследования тканей не годятся для популяционных обзоров и оказываются наиболее полезными, если сочетаются с выявлением изменений в крови и моче.

Клеточные культуры. Существенный вклад в биохимию и генетику врожденных метаболических аномалий внесли также исследования на растущих в тканевой культуре фибробластах человека. В некоторых случаях (акаталазия, галактоземия, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, болезнь накопления гликогена II типа, экскреция с мочой повышенного количества кетокислот с разветвленной цепью или оротовой кислоты) ферментные нарушения, ранее выявленные в других тканях, были подтверждены на культуре фибробластов. При цитруллинемии и болезни Рефсума специфические ферментные аномалии вначале были обнаружены именно в фибробластах, а при синдроме Леша —Найхана нарушение активности гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы было выявлено одновременно в эритроцитах, лейкоцитах и культивируемых фибробластах. Имеют значение и аномалии, определяемые в клетках гетерозиготных носителей. Например, исследование облигатных гетерозигот по ряду сцепленных с Х-хромосомой признаков позволило получить подтверждение справедливости гипотезы Лиона.

Анализ ДНК. Использование методики блот-гибридизации ДНК —ДНК для диагностики наследственных метаболических нарушений явилось наиболее важным вариантом применения технологии рекомбинантной ДНК в медицине (см. гл.58). Этот подход основывается на выделении ДНК из легко доступных тканей, например лейкоцитов периферической крови, культивируемых фибробластов или клеток амниотической жидкости. После расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеазами и определения размеров полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза проводят реакцию с мечеными зондами к специфическим генам из конкретных локусов, ответственным за конкретные нарушения. Если молекулярный дефект, лежащий в основе нарушения, точно известен, как, например, при серповидно-клеточной анемии или Z-варианте a1-антитрипсина, то можно подобрать строго определенные олигонуклеотидные зонды. В других случаях диагностика осуществляется легче путем регистрации полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, подразделяемых на семейства и служащих полезными маркерами болезни (см. гл.58). Этот подход использован для диагностики болезни Гентингтона, фенилкетонурии, цитруллинемии, синдрома Леша —Найхана и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

Выявление гетерозигот. Выявление гетерозиготных носителей двояко влияет на изучение врожденных дефектов. Во-первых, оно наглядно доказывает рецессивность наследования заболевания независимо от того, является ли мутация аутосомной или сцепленной с Х-хромосомой. Во-вторых, идентификация гетерозиготных носителей в одной семье позволяет получить важные сведения для генетического консультирования ее членов. При заболеваниях, при которых у носителей могут появиться клинические признаки (т. е. при доминантно наследуемых дефектах, таких как острая перемежающаяся порфирия или семейная гиперхолестеринемия), выявление гетерозигот имеет непосредственное клиническое значение.

Гетерозигот можно идентифицировать с помощью многих методов, используемых для выявления дефектов у больных. В некоторых случаях для выявления носителя достаточно применить методы скрининга проб крови или мочи. В других полезными оказываются ферментативные методы. При ряде заболеваний анализ крови или мочи не позволяет разграничить здоровых лиц и гетерозиготных носителей, но последних помогают выявить пероральные или парентеральные нагрузки предшественником в цепи нарушенной химической реакции. Так, гетерозиготы по галактоземии и фенилкетонурии реагируют на пероральную нагрузку соответственно галактозой и фенилаланином более высоким уровнем их в плазме по сравнению со здоровыми. Носители ряда заболеваний выявляются с помощью ферментативных методов или по фенотипу клеток в биоптатах. Наконец, для их выявления и, что важно, для исключения носительства часто применяют методы гибридизации ДНК —ДНК. Обычно этими методами пользуются лишь в одном или в немногих центрах. В силу их сложности они не применяются для выявления носителей в крупных популяциях.

Пренатальные исследования. В настоящее время большой интерес вызывает выявление генетических болезней во внутриутробном периоде (см. гл.58). Химическое исследование амниотической жидкости или ферментативный анализ ее клеток позволил идентифицировать более 50 врожденных метаболических нарушений.

Наиболее многочисленную группу заболеваний, выявленных этим методом, составляют болезни накопления мукополисахаридов и липидов, обусловленные недостаточностью отдельных лизосомных гидролаз. Однако этим способом идентифицированы и нарушения метаболизма амино- и органических кислот, углеводов и пуринов. Несколько врожденных аномалий установлено путем исследования крови плода, полученной при пункции плаценты или фетоскопическом контроле. Таким путем выявлены серповидно-клеточная анемия, b-талассемия и гемофилия. Если все эти подходы основаны на исследовании генных продуктов или метаболитов, то диагностика других нарушений осуществляется с помощью методики блот-гибридизации ДНК —ДНК. Последние методики особенно перспективны, так как позволяют использовать клетки, например, амниотической жидкости в культуре, которые содержат, но не экспрессируют гены, осуществляющие многие высокодифференцированные функции, включая синтез глобина и полипептидных гормонов. Блот-гибридизация ДНК —ДНК применялась для пренатального выявления фенилкетонурии, недостаточности а i-антитрипсина, гемофилии, серповидно-клеточной анемии, талассемии и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

Читать далее: Генетический скрининг