Меню
Яндекс.Метрика

Диагностика вирусных болезней

Диагностика таких вирусных болезней, как корь, может быть осуществлена на основании клинических признаков. В других случаях с помощью клинических данных можно лишь идентифицировать группу вирусов, которые, вероятнее всего, являются возбудителями болезней той или иной категории. Однако, как правило, бывает необходимо установить точный диагноз, так как имеющиеся антивирусные препараты обладают высокой избирательной активностью по отношению к определенным типам вирусов. Для постановки точного диагноза необходимо воспроизвести вирус у экспериментального животного или в культуре ткани, идентифицировать вирус или выделить вирусспецифические антигены или вирусные нуклеиновые кислоты из тканей или жидкостей организма, или документально зарегистрировать специфические серологические реакции. Врач должен обеспечить взятие необходимых для диагностического исследования проб материала в соответствующую фазу заболевания, проследить, чтобы они были быстро отправлены в лабораторию, снабдить диагностические лаборатории адекватной клинической информацией.

Если заболевание сопровождается диареей или другими желудочно-кишечными расстройствами, этиология которых напоминает вирусную, вирус следует выделить из свежей порции фекалий. При заболеваниях дыхательной системы, включая фарингит, круп, бронхиолит и пневмонию, материал для исследований лучше всего получать путем аспирации слизи. Мазки из носоглотки и горла менее информативны. При наличии везикулярной сыпи материалом для исследования служит жидкость, аспирированная из пузырьков с помощью иглы. Если сыпь имеет петехиальный или макулопапулезный характер, то следует собирать как пробы слизи из носоглотки, так и фекалии. У пациентов с заболеваниями центральной нервной системы, природа которых позволяет предположить вирусную, включая менингит, энцефалит, миелит и синдром Гийена—Барре, для исследования следует собирать назофарингеальный аспират, фекалии и пробы спинномозговой жидкости. При подозрении на инфекцию, вызванную ЦМВ, паповавирусами, корь или эпидемический паротит целесообразно исследовать мочу. Попытку выделить вирус из крови можно предпринять при подозрении на инфекции, вызванные некоторыми арбовирусами, вирусами герпеса и ЛСМ. Для диагностики бешенства и эпидемического паротита исследуют слюну. Биопсия мозга может потребоваться при диагностике энцефалита, вызванного вирусом простого герпеса, прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии, подострого склерозирующего панэнцефалита (ПСПЭ), прогрессирующего краснушечного панэнцефалита и медленных вирусных инфекций, таких как болезнь Крейтцфельда— Якоба.

Препараты мазков из носоглотки или прямой кишки следует помещать в соответствующую среду для транспортировки, которая представляет собой несколько миллилитров нейтрального изотонического раствора поваренной соли с добавлением небольшого количества белка или сыворотки животных и антибиотиков. В случае задержки транспортировки препаратов их следует поместить во фляжку-термос, заполненную кусочками льда. После того как препараты доставлены в вирусологическую лабораторию, их следует поместить в соответствующие условия для дальнейшей обработки. Препараты могут храниться в обычном холодильнике при температуре 4°С не более 48 ч. Более длительное хранение должно осуществляться при температуре —70°С. При многократном замораживании и оттаивании многие вирусы быстро теряют инфекционную активность.

Выделение вируса из клинического препарата осуществляется путем посева материала на культуру тканей, куриные эмбрионы или инокуляции новорожденным мышам. Метод культуры тканей подразумевает использование первичных клеточных культур, изготовленных из органов животных (например, клетки почек обезьяны); линии диплоидных клеток человека, таких как фибробласты эмбриона Wi-38 и перевиваемые клеточные линии типа HeLa, HEp-2, BHK-21 и Vero. Некоторые вирусы лучше растут на одних клеточных линиях, другие — на других. Вирус гриппа следует выделять путем инокуляции вируссодержащего материала в амниотическую или аллантоисную полость куриного эмбриона. Интраперитонеальная и интрацеребральная инокуляция новорожденным мышам рекомендуется для выделения вируса Коксаки А, а также многих арбовирусов, вируса бешенства, аренавирусов и орбивирусов. Для выделения вируса ЛСМ могут быть использованы взрослые мыши или морские свинки. Идентификация агента, ответственного за возникновение медленной вирусной инфекции, например куру и болезнь Крейтцфельда—Якоба, может потребовать внутричерепной инокуляции материала высшим приматам, например шимпанзе. Специальные методы изоляции вируса с использованием искусственной среды ткани мозга необходимы для идентификации вируса кори в случае ПСПЭ или вируса краснухи у больных с прогрессирующим краснушечным панэнцефалитом.

После заражения вируссодержащим материалом клеточной культуры последнюю исследуют на наличие отличительных признаков цитопатического действия ЩПД). Такие вирусы, как НСВ и многие энтеровирусы, оказывают раннее ЦПД, в то время как для выявления ЦПД, вызванного ЦМВ, вирусом краснухи и некоторыми аденовирусами, требуется наблюдать за клеточными культурами в течение недель и даже выращивать субкультуры. В культивируемых клетках ищут признаки их лизиса и вакуолизации. Присутствие синцития свидетельствует о возможном наличии НСВ, PC-вируса, вируса кори или эпидемического паротита. Окрашивание клеточных культур по Гимзе или с использованием других красителей облегчает поиск и обнаружение различных внутриклеточных включений. Иммуноцитохимическое окрашивание клеточных культур для выявления вирусных антигенов с использованием флюоресцеина или специфических антивирусных антител, связанных с ферментом, способствует обнаружению и идентификации многих вирусов, оказывающих минимальный ЦПЭ. Орто- и парамиксовирусы (вирусы гриппа, парагриппа, кори, эпидемического паротита) могут быть обнаружены по способности инфицированных культур тканей адсорбировать эритроциты (гемадсорбция). Вирус краснухи выявляют по способности инфицированных культур блокировать ЦПЭ, вызванный другим вирусом (интерференция).

Идентификация вирусных частиц или антигенов в тканевых препаратах представляет собой другой важный метод диагностики вирусной инфекции. Окрашивание соскоба кожи, взятого из основания пузырька, по методу Tzanck с применением красителя Райта или Гимзы помогает идентифицировать вирус простого герпеса или вирус ветряной оспы. Аналогичные методики позволяют идентифицировать клетки, инфицированные ЦМВ в осадке мочи, или клетки, инфицированные вирусом кори, в соскобах, взятых из пятен Коплика. В некоторых случаях важную диагностическую информацию можно получить при электронно-микроскопическом исследовании специально подготовленных препаратов. Концентрация вирусных частиц в таких препаратах должна быть более 1067 частиц в 1 мл. Применение специального метода концентрации вируса в препарате путем адсорбции избытка жидкости и солей на поверхности агарозы позволяет обнаружить вирус при его концентрации всего 104 частиц в 1 мл (метод псевдорепликации). С помощью электронной микроскопии можно без труда отличить вирус оспы коров от вируса ветряной оспы в везикулярной жидкости, отрицательно окрашиваемой фосфотунгусной кислотой. Кроме того, электронная микроскопия может быть чрезвычайно полезна при идентификации таких кожных вирусов, как вирус папилломы человека, вирус контагиозного пустулезного дерматита и контагиозного моллюска. Использование специфической антисыворотки для агрегации вируса в препарате фекалий облегчает электронно-микроскопическое выявление ротавирусов, вируса гепатита А и вируса Норфолк. Электронно-микроскопические исследования препаратов биопсии мозга могут позволить идентифицировать энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса, ПМЛ и ПСПЭ.

Обнаружение вирусспецифических антигенов облегчается при использовании методов иммунофлюоресценции и иммуноцитохимии. Ценность этих методов особенно высока при диагностике бешенства, герпетической инфекции, ПМЛ и ПСПЭ в препаратах биопсии мозга; герпетического кератита в соскобах роговицы; вируса простого герпеса, ветряной оспы и оспы коров в соскобах пузырьков; пара-гриппа, гриппа и РСВ-инфекции в аспиратах слизи из носоглотки: гепатита В в препаратах биопсии печени; вируса колорадской клещевой лихорадки в кровяном сгустке. Вирусные антигены могут быть обнаружены в препаратах этих тканей при использовании вирусспецифических антител, прямо или косвенно связанных с флюоресцеинизотноцианатом (ФИТЦ) или ферментами, включая пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу и глюкозоксидазу. Использование антител, связанных с ферментами, обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной световой микроскопией: при этом повышается чувствительность, сохранность окрашенных препаратов, их диагностическая ценность. Сочетание биотинсвязанных антител с авидинсвязанным ФИТЦ или ферментами позволит повысить результативность иммуноцитохимических методов. Для выявления вирусных антигенов используют радиоиммунный анализ и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), методы, хорошо зарекомендовавшие себя при диагностике гепатита А и В, ротавирусов, аденовирусной инфекции.

Обнаружение четырехкратного или более повышения титра антител к специфическому вирусному агенту в сыворотке больного в острой фазе заболевания или на стадии выздоровления (3—4 нед спустя) принято рассматривать в качестве диагностического признака острой инфекции. Однократно проведенное исследование лишь в редких случаях позволяет диагностировать вирусную болезнь. Высокий титр антител против достаточно редко встречающегося агента при наличии типичной клинической ситуации или необычный титр антител к вирусному антигену специфического типа дают основание лишь предположить наличие острой инфекции. В подобных случаях необходимо серологическое исследование крови. Кровь собирают в стеклянные пробирки без антикоагулянтов или консервантов, получают сыворотку и дают ей свернуться и замораживают для дальнейшего хранения. При исследовании в сыворотке определяют антитела различного типа, включая нейтрализующие, комплементсвязывающие и подавляющие гемагглютинацию. Скорость реакций, чувствительность и специфичность их при выявлении различных антител существенно варьируют.

Большое значение при проведении эпидемиологических исследований и установлении происхождения некоторых типов изолированных вирусов имеет рестрикционный ферментативный анализ геномов вирусов, содержащих ДНК (вирус простого герпеса, ветряной оспы, ЦМВ), и получение олигонуклеотидных отпечатков рибонуклеазы t1 расщепленных геномов РНК-вирусов (грипп, вирус Денге). Для обнаружения вирусных геномов в тканевых препаратах используют гибридизацию in situ. Выявление вирусных нуклеиновых кислот в препаратах тканей и жидкостей организма с применением клонированных вирусспецифических нуклеокислотных зондов представляет собой еще один метод непосредственной идентификации вирусных патогенов.

Читать далее: Профилактика вирусных болезней