Выявление микробных антигенов, побочных продуктов и геномов
В связи с относительной неспецифичностью многих прямых микроскопических методов и длительным промежутком времени, необходимым для получения результатов посева, применяется ряд технических приемов, направленных на быстрое выявление микробных антигенов, побочных, продуктов и геномов.
Встречный иммуноэлектрофорез. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) — наиболее широко применяемый метод выявления антигена. В этом варианте диффузии в агаровом геле материал, исследуемый на наличие антигена, помещается в канавку (лунку), сделанную в агаре, а специфическая антисыворотка— в другую (близлежащую) канавку. Затем через агар пропускается электрический ток, в результате чего происходит быстрое, в течение нескольких минут сближение антигена и антитела и слияние их с образованием преципитата. Доказано, что ВИЭФ является наиболее эффективным методом быстрой диагностики бактериальных менингитов у детей, когда цереброспинальная жидкость исследуется на наличие антигенов пневмококка, менингококка, стрептококка группы В или Н. influenzae. Метод обладает такой же чувствительностью, как окраска по Граму, но является более специфичным. ВИЭФ применяется также для выявления вышеупомянутых бактериальных антигенов в сыворотке крови, пневмококковых капсульных антигенов в мокроте, ротавирусов и энтеровирусов в фекалиях.
Реакция агглютинации частиц. Эти тесты используются в тех же целях, что и ВИЭФ, однако требуют для своего выполнения меньшего технического мастерства. Хотя реакция агглютинации частиц характеризуется большей чувствительностью, как в латекс, так и в коагглютннационной реакциях могут иметь место ложноположительные результаты, обусловленные термолабильными компонентами сыворотки и ревматоидным фактором. По всей вероятности, наиболее эффективны эти реакции для выявления бактериальных антигенов в моче и цереброспинальной жидкости детей с острым менингитом и выявления криптококкового антигена в крови и цереброспинальной жидкости больных хроническим менингоэнцефалитом.
Реакции агглютинации частиц были использованы для выявления пневмококков в мокроте, стрептококков группы А в мазках из зева, антигена Candida в сыворотке крови, ротавирусов и энтеротоксина С. difficile в фекалиях. Однако роль этих тестов в диагностике нуждается в уточнении.
Радиоиммунологическое исследование (RIA). Этот метод наиболее эффективен для обнаружения поверхностно-связанного антигена гепатита В (HBsAg) и профилактики инфекций такого рода с помощью скрининговых исследований крови и ее продуктов на присутствие антигена. Эта процедура высокочувствительна и при применении доступных коммерческих тест-наборов результаты могут быть получены в течение нескольких часов. В этом методе HBsAg, меченный 125I, конкурирует с антигеном в тест-сыворотке за специфические антитела в тест-смеси. Свободные и связанные антитела разделяются отмыванием. Затем с помощью гамма-счетчика анализируется реактивность комплекса антиген — антитело. Для обнаружения циркулирующих антигенов при диссеминированных грибковых инфекциях был разработан экспериментальный метод радиоиммунологического исследования.
Иммуноферментные исследования. Этот метод, описанный выше в разделе Прямое микроскопическое исследование, может применяться для визуального или спектрофотометрического выявления микробных антигенов. Более того, этот метод начинает применяться вместо радиоиммунологических исследований в диагностике гепатитов А и В и широко используется для обнаружения ротавирусов в фекалиях младенцев при диарее. Он с успехом применялся для выявления циркулирующих антигенов при кандидозс, аспергиллезе и токсоплазмозе. Иммуноферментное исследование может сыграть в будущем важную роль в диагностике С. trachomatis, а также цервицитов и уретритов гонококковой этиологии.
Скрининговое исследование мочи. В распоряжении исследователя имеется большое число немикросконических коммерческих тестов, позволяющих проводить скрининг бактериурии. Каждый из них преследует цели сокращения времени и снижения стоимости исследований, направленных на диагностику инфекций мочевого тракта. Для определения наличия или отсутствия в пробе мочи бактериальных и/или лейкоцитарных ферментов применяются биолюминесценция, фильтрация-колориметрия или химические реакции. Указанные тесты могут быть выполнены лицами, имеющими минимальную техническую квалификацию, и требуют для выполнения всего несколько минут. Обычно пробы мочи, которые дают положительные результаты при скрининге, подвергаются затем культуральному исследованию; те пробы, которые дают отрицательный результат, выбрасываются, а отрицательный результат сообщается как таковой. Чувствительность, специфичность и воспроизводимость этих тестов практически не отличаются от таковых, получаемых опытным микробиологом при микроскопическом исследовании окрашенных мазков мочи. Все достоверно отобранные как положительные при скрининге пробы содержат 105 и более колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл мочи, однако при меньшей величине КОЕ скрининговые методы не чувствительны. Значи+ельно более высокая стоимость скрининговых тестов по сравнению с микроскопическим исследованием частично возмещается их технической простотой. Окончательная роль скрининговых тестов в выявлении бактериурии остается неопределенной.
ДНК-пробы. Использование рекомбинантных ДНК-методов сделало возможным выделение, репродукцию и маркировку микроорганизмов со строго определенным уникальным расположением нуклеотида из генома специфических микроорганизмов, представляющих штамм, вид, род или группу. Эти меченные фрагменты ДНК могут быть добавлены к тканевым жидкостям, экссудатам или тканям, предположительно содержащим патогенный агент. Из смеси, обработанной нагреванием или химикалиями, выделяется микробная ДНК соответствующего уникального состава. После обработки фрагменты ДНК нагреваются повторно. Эта реассоциация, или гибридизация, высокоспецифична и происходит только между фрагментами, несущими взаимодополняющие друг друга нуклеотиды. Если материал содержит нуклеотид, последовательно дополняющий те, которые находятся в пробе, они будут гибридизированы и маркированы.
Потенциальное преимущество таких проб состоит в их уникальной специфичности, способности выявлять единственный патоген среди множества других и идентифицировать микроорганизмы, которые либо сложно, либо невозможно выявить культуральными методами. Наиболее благоприятным приложением для этих методов является диагностика вирусных, хламидийных, микобактериальных, энтеробактериальных и паразитарных инфекций. ДНК-пробы уже разработаны для самых разнообразных микроорганизмов, включая вирус I и II простого герпеса, цитомегаловирус, энтеровирусы, вирус Эпстайна — Барра, вирус гепатита В , аденовирус, вирус опоясывающего лишая, ротавирус, вирус Т-клеточного лейкоза человека, энтеротоксигенные штаммы кишечной палочки Yersinia enterocolitica, сальмонеллы, шигеллы, кампилобактер, микобактерии, Leishmania mexicana, L. braziliensis, Plasmodium falciparum. В настоящее время только пробы с кишечной палочкой подвергаются широкомасштабным клиническим испытаниям.
В конечном счете широта применения ДНК-проб в клинической медицине зависит от упрощения и степени коммерциализации процедуры гибридизации, а также развития практичных, высокочувствительных маркеров. В настоящий момент в большинстве проб используются радиоизотопные маркеры (обычно 32Р). Эти вещества характеризуются высоким уровнем чувствительности, но требуют продолжительной обработки для ауторадиографического выявления, имеют чрезвычайно ограниченный срок хранения, требуют соблюдения специальных условий хранения и удаления радиоактивных отходов, что практически исключает их применение в клинических лабораториях. Разработка колориметрически выявляемых ферментных маркеров позволила преодолеть эти отрицательные моменты, однако оказалось, что все предложенные в настоящее время маркеры несколько менее чувствительны, чем радиометрические, и бесспорно менее чувствительны, чем большинство культуральных методов. С развитием более пригодных нерадиометрических маркеров ДНК-проба сможет в значительной степени изменить практиче ские и фундаментальные аспекты диагностики и лечения инфекционных болезней. Однако маловероятно, что она заменит культуральные методы исследования при инфекциях, в которых выделение, характеристика и определение лекарственной чувствительности патогенного агента являются решающим указанием для соответствующего лечения больного.
Газовая хроматография. Этот метод заключается в прямом исследовании клинических материалов с помощью газожидкостной хроматографии с целью выявления характерных продуктов метаболизма микроорганизмов.
Метод эффективен при дифференциац ии аэ робных и анаэробных микроорганизмов в гное и крови. Он применяется также для дифференциации артритов стафилококковой, стрептококковой и гонококковой этиологии от травматических и для выявления дрожжеподобных грибов рода Candida в крови больных с гематогенной грибковой инфекцией. Хотя роль газовой хроматографии в идентификации анаэробных бактерий считается установленной, целесообразность ее использования при прямом исследовании клинического материала нуждается в уточнении.
Читать далее: Культуральное исследование