Глава 83. Диагностика инфекционных болезней
Для диагностики инфекционной болезни требуется прямое или непрямое обнаружение патогенного микроорганизма в тканях пораженного макроорганизма. В данной главе описаны основные методы, с помощью которых это достигается.
Прямое микроскопическое исследование. Прямое микроскопическое исследование тканевых жидкостей, экссудатов и тканей является одновременно самым простым и одним из наиболее информативных лабораторных методов, применяемых в диагностике инфекционных болезней. Во многих случаях это исследование позволяет провести точную, высокоспецифичную идентификацию этиологического агента. Примерами могут служить распознавание Borrelia или Plasmodium в мазках крови, полученных от больных с рецидивирующей лихорадкой или малярией. На основании изучения морфологии возбудителя может быть произведена более общая , предположительная идентификация его. Тем не менее эта информация часто бывает достаточной для того, чтобы выбрать соответствующий химиотерапевтический препарат в ожидании результатов более точных исследований. При прямой микроскопии используют множество методик. Если искомый агент имеет большие размеры или характерную морфологию, из исследуемого материала можно приготовить неокрашенные влажные препараты и исследовать в светлом поле, в темном поле или с помощью фазово-контрастной микроскопии. Гораздо чаще для прямой микроскопии приготавливают высушенные мазки; это позволяет применить разнообразные окраски, которые облегчают выявление и идентификацию искомого микроорганизма.
Влажные препараты. Исследование в темном поле отделяемого пораженных половых органов на бледную трепонему хорошо известно, но им обычно пренебрегают. Влажные препараты часто используют для диагностики грибковых и паразитарных инфекций. Для установления диагноза поверхностных микозов целесообразно исследовать фрагменты волоса, кожные чешуйки или срезанные ногтевые пластинки в капле 10% раствора КОН. Иногда, как это имеет место при опоясывающем лишае, грибковые элементы настолько характерны, что позволяют произвести специфическую идентификацию этиологического агента по данным одной микроскопии. На основании этой процедуры в ряде случаев может быть установлен предположительный диагноз системной грибковой инфекции. Примерами являются криптококковый менингит, диагностируемый при выявлении инкапсулированного микроорганизма в препарате цереброспинальной жидкости, окрашенном индийскими чернилами, и кокцидиоидоз, идентифицируемый в результате нахождения в выделяемой больным мокроте характерных сферул.
Исследование влажных препаратов фекалий или дуоденального содержимого также является первоначальным этапом в установлении диагноза кишечных паразитарных инфекций, таких как амебиаз и криптоспоридиоз. Более того, это исследование играет важную роль в диагностике гельминтозных инвазий кишечника, включая аскаридоз, трихоцефалез, стронгилоидоз и анкилостомоз. Наконец, на основании обнаружения характерных движений микрофилярий и трепонем в крови и других тканевых жидкостях могут быть распознаны филяриатоз и сонная болезнь.
Микроскопия окрашенных препаратов. Несмотря на множество технических достижений в области микробиологии, окраска по Граму остается после 90 лет ее применения наилучшим и единственным широкодоступным методом быстрой диагностики бактериальных инфекций. Она используется при исследовании фактически всех видов клинических материалов, причем наибольшую ценность эта окраска имеет при исследовании экссудатов, аспиратов и тканевых жидкостей, включая церебральную жидкость и мочу. Препараты, окрашенные по Граму, сначала исследуют при малом увеличении микроскопа для выявления окрашенных в розовый цвет воспалительных клеток. Наличие единичных таких клеток в присутствии большого количества клеток плоского эпителия позволяет предположить, что материал был загрязнен во время сбора и может недостаточно объективно отражать состояние воспалительного процесса. Затем препарат исследуется с использованием масляной иммерсии; бактерии выявляются либо как темно-синие (грамположительные), либо как розовые (грамотрицательные) тела. Их окраска и морфологические особенности часто позволяют производить предварительную идентификацию рода, а иногда и вида микроорганизма. Выявление пневмококков в мокроте, Enterobacteriaceae в моче, стафилококков в содержимом локализованных абсцессов, гонококков в отделяемом мочеиспускательного канала, клостридий в зловонных выделениях и пневмококков, менингококков или Haemophilus influenzae в окрашенных мазках цереброспинальной жидкости позволяет начать специфическую химиотерапию с уверенностью, что подобран адекватный режим. У некоторых больных с иммуносупрессией в мазках крови можно обнаружить бластоконидии и псевдогифы Candida за несколько дней до того, как кандидемия может быть установлена методом посева.
Целый ряд специфических микроорганизмов может быть выявлен при окрашивании другими методами. Так, окрашенные основным карболовым фуксином или одним из флюорохромов микобактерии обладают уникальной способностью противостоять обесцвечиванию растворами сильных минеральных кислот и алкоголем. Благодаря этому они немедленно распознаются в тканях и жидкостях организма. Присутствие в выделяемой больным мокроте большого количества кислотоустойчивых бактерий позволяет установить предположительный диагноз туберкулеза органов дыхания и является важным основанием для начала систематических культуральных исследований всего доступного материала от больного, а также для назначения ему противотуберкулезных средств. Последующее систематическое исследование мокроты на кислотоустойчивые микобактерии является важным составным элементом мониторинга по оценке эффективности лечения. В настоящее время традиционные методы окраски по Цилю — Нильсену и Kinyoun вытеснены окраской флюорохромами, которая позволяет гораздо быстрее исследовать мазки, применяя относительно небольшое увеличение.
Окраску на кислотоустойчивые бактерии можно применять также для идентификации микроорганизмов рода Cryptosporidium в фекалиях больных диареей. Обесцвечивание окрашенных мазков минеральными кислотами позволяет выявлять в тканевых жидкостях и экссудатах патогенные штаммы Nocardia. В случае использования для обесцвечивания более слабых агентов, например органических кислот, могут быть обнаружены микроорганизмы рода Actinomyces.
Окраска по Гимзе и йодом может быть использована для диагностики вызванных хламидиями инфекций глаз, мочеиспускательного канала или шейки матки. В окрашенных по Гимзе мазках из соскобов с пораженных участков этих органов выявляются эпителиальные клетки с типичными полулунными плотными включениями, состоящими из многочисленных голубых или фиолетовых частиц, примыкающих к ядру клетки. При окраске йодом в соскобах с пораженных участков глаз выявляются аналогичные красновато-коричневые массы, однако для исследования материала из канала шейки матки эта окраска неэффективна.
Существует множество методов окраски, пригодных для идентификации паразитов. Так, Pneumocystis carinii может быть идентифицирована в материалах трансбронхиальной щелочной биопсии с помощью модифицированной окраски Wright, толуидиновым синим или метенаминовым серебром. Последний метод позволяет выявить очень характерные окрашенные в черный цвет цисты Простейшие микроорганизмы, паразитирующие в крови и тканях, такие как плазмодии малярии и лейшмании, лучше всего выявляются при окраске смесью типа Романовского, содержащей метиленовый синий и эозин. При этой окраске ядра приобретают красно-фиолетовый цвет, а цитоплазма — голубой. С другой стороны, при идентификации кишечных простейших необходимо применять такие краски, как железистый гематоксилин или хром, которые позволяют выявлять таксономически важные детали строения ядра.
Иммунная микроскопия. В этом методе сочетаются специфичность иммунологических исследований со скоростью прямой микроскопии. При использовании иммунофлюоресцентной техники мазки, предположительно содержащие вирусные, бактериальные, грибковые или паразитарные микроорганизмы, окрашиваются с помощью препаратов, содержащих специфические антитела, меченные флюоресцентными красителями, и исследуются в люминесцентном микроскопе. Наиболее эффективно применение этого метода при исследовании ткани мозга на наличие вируса простого герпеса или оспы; ткани легких, плевральной жидкости или мокроты на наличие легионелл; соскобов с шейки матки, уретры или конъюнктивы на наличие характерных для трахомы включений. Прямая флюоресцентная окраска мазков-отпечатков с эпителия полости носа может использоваться для быстрой диагностики вирусного гриппа, парагриппа и инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом. Метод прямой иммунофлюоресценции для выявления покрытых антителами бактерий в осадке мочи оказался эффективным для дифференциальнои диагностики инфекции в почках и в мочевом пузыре у женщин.
Точность и достоверность метода иммунбфлюоресценции продолжает улучшаться в связи с тем, что устаревшие поликлональные сыворотки заменены более специфичными моноклональными реагентами. Однако необходимость иметь в наличии дорогие люминесцентные микроскопы; недостаток многих дорогих коммерческих конъюгированных антисывороток, потребность в высококвалифицированных специалистах ограничивают применение этих методов рамками референс лабораторий.
Ферментносвязанные иммуносорбентные тесты (ELISA) аналогичны иммунофлюоресцентным, за исключением того что антисыворотка реагирует с меченным ферментом антивидовым конъюгатом. После обработки соответствующим субстратом появляется изменение окраски, улавливаемое под обычным световым микроскопом, а связи с чем отпадает необходимость в дорогостоящем оборудовании.
Электронная микроскопия. Электронно-микроскопическое исследование используется для идентификации определенных вирусов, не обладающих цитонатическим эффектом в культуре клеток. Оно. особенно ценно для выявления ротавирусов в фекалиях младенцев и детей раннего возраста, страдающих гастроэнтеритом. Большое количество и характерная морфология этих вирусных частиц позволяют провести их специфическую идентификацию на основании одних морфологических признаков. Электронная микроскопия может быть использована также для диагностики так называемой болезни зимней рвоты, вызываемой микроорганизмами родов Norwalk и Hawaii. Возбудители морфологически аналогичны представителям группы пикорнавирусов, а для специфической иден тификации их необходима агрегация вирусных частиц иммунной сывороткой. Этот метод иммунной электронной микроскопии может получить широкое применение в вирусологии и используется для идентификации вирусоподобных микроорганизмов, выявляемых у экспериментальных животных при гепатитах, не относящихся к группам А и В.
Читать далее: Выявление микробных антигенов, побочных продуктов и геномов